第四章 臨床生化檢驗方法的選擇和評價

一、 檢驗方法的正確選擇

臨床生化檢驗方法根據其準確度與精密度的不同可以分為決定性方法、參考方法、常規方法等三級。

1.決定性方法 是指準確度最高，系統誤差最小，經過詳細的研究，沒有發現產生誤差的原因或在某些方面不夠明確的方法。用于發展及評價參考方法和一級標準品。

2.參考方法 是指準確度與精密度已經充分證實的分析方法，干擾因素少，系統誤差與重復測定的隨機誤差相比可以忽略不計，有適當的靈敏度、特異性及較寬的分析范圍。這類方法在條件許可的實驗室中應經常使用。用于評價常規方法和試劑盒，鑒定二級標準品。

3.常規方法 指性能指標符合臨床或其他目的的需要，有足夠的精密度、準確度、特異性和適當的分析范圍，而且經濟實用。這類方法經有關學術組織認可后可稱為推薦方法，推薦方法應具有足夠的實驗證據。

國際標準化委員會將標準品(參考物)的定義暫定為：它的一種或幾種物理或化學性質已經充分確定;被用于校正儀器或用于評價一種測定方法的物質，并將其分成三級。

1.一級標準品(原級參考物) 是一種穩定而均一的物質，它的數值已由決定性方法確定，或由高度準確的若干方法確定，所含雜質也已經定量，且有證書;用于校正決定性方法，評價及校正參考方法以及為二級標準品定值。

2.二級標準品(次級參考物) 也稱校準品，包括用于常規分析的標準液。這類標準品可由實驗室自已配制或為商品，它的示值必須用一級標準品和參考方法并由訓練有素的，能熟練掌握參考方法的操作者確定;主要用于常規方法的評價或為控制物定值和常規測定的結果計算。

3.校準品 用二級標準品和常規方法測定得到校準品，用于常規測定中的標準。

國際臨床化學協會(IFCC)提出：常規方法應具有實用性和可靠性兩方面的性能指標，至于某一項具體分析方法所應具有的性能標準，可由臨床化學家根據采用這一試驗的目的決定。

(1)實用性：一般應具備微量快速，便于急診;費用低廉;應用安全。

(2)可靠性：一般具有較高的精密度和準確度，以及較大的檢測范圍。精密度即變異系數(CV%)一般應小于5%。準確度是指測定值與"真值"的符合程度，一般偏差系數(CB)應小于5%。特異性是指只對待測物質起化學反應，不與其他結構類似的化合物發生反應。檢測能力即"檢測限度"或"檢出限"。檢出限通常是指能與適當的"空白"讀數相區別的待測物的最小量。

二、臨床生化檢驗方法學評價

方法學評價的基本內容是通過實驗途徑，測定并評價方法的精密度與準確度，在實驗中測定的是不精密度與不準確度，無論是精密度還是準確度，強調的都是誤差，評價實驗的過程就是對誤差的測定。

(一)精密度評價

1. 目的要求 評價方法給出結果的可重復程度即精密度。

2.評價前的準備 ①對于評價對象和評價方案均應熟悉。②實驗用試劑應是同批次配制，或同一批號的商品試劑盒和參考物，儀器也應處于良好的工作狀態。③實驗用標本一般選擇2個(亦可更多)，一個在正常范圍或在醫學決定水平附近，另一個為異常值，被測物在疾病時增高者用高值，降低者用低值;實驗標本的介質應與臨床標本一致，并應妥善保存，應保證在整個實驗過程中穩定。④先作一個初步的批內精密度測定，即一個標本重復測定20次，計算出均值，標準差和變異系數。

3.評價步驟 用2個標本每天測定2次(2次測定間隔不得少于2小時)，每次測定均作雙份，共測定20天。每次測定至少做一個質控。

(二)準確度評價

1.方法比較試驗 目的是評價方法所給出的結果是否準確，在實驗的范圍內兩方法間的平均差異，并確定偏差。

(1)要求 方法比較試驗理論上是兩種方法間的差異均作為試驗方法的偏差。因此比較方法應是參考方法或推薦方法，如該測定沒有參考方法或推薦方法亦可用公認的常規方法。但須具備：①比較試驗方法有更好的精密度。②干擾影響已知。③與試驗方法使用相同的計算單位。

(2)比較前準備 ①實驗者應熟悉所用的儀器、試驗方法、比較方法和評價方案。②實驗標本應收集新鮮的正常和異常的臨床標本，應有足夠寬的濃度范圍，各濃度應有合適的比例。

(3)方法比較步驟 ①樣本數至少為40個標本，每個標本用2種方法分別作雙份測定。②每天測定8個標本，雙份測定時第一次按順序1，2……7，8，第二次8，7……2，1，共測試5天。

2.回收試驗 所謂回收即分析方法正確測定加入常規分析樣品中的純分析物的能力。目的是測定比例系統誤差，以衡量候選方法的準確度。

(1)方法：將被分析的純品標準液加入樣品中，成為分析樣品，原樣品加入同量的無分析物的溶液作基礎樣品，然后用實驗方法分析，兩者測定結果的差值為回收量。

(2)回收率計算：理想的回收率為100%，如某法測血鈣的回收率為95.7%，有4.3%的比例誤差，表明一個含鈣真值為2.5mmol/l的標本,若用該方法測定,約為2.39mmol/l(2.5×95.79% )，誤差為0.11mmol/L(2.5Χ4.3%)。

(3)注意事項：① 準確吸量; ② 樣品中加入標準液后,總的濃度必須在方法的分析范圍內，一般須加入高、中、低不同濃度做回收試驗，計算平均回收率;③ 加入標準液后，最好使實驗樣品的被測濃度達到醫學決定濃度; ④ 加入標準液的體積一般在10%以內。若稀釋過大，誤差將發生改變，甚至消失。

(三)線性評價

1.目的要求 線性范圍能判斷對某一分析方法測得的濃度或活性值與設定的濃度或活性值之間的比例關系的范圍。常規方法應具有較寬的分析范圍，一般應覆蓋臨床可能出現的高值。

2.評價前準備 ①熟悉儀器、評價方案和試劑。②評價標本的介質應與實際測定的標本相一致，理想的標本是病人的低值或高值標本。③濃度范圍應以分析項目的線性要求為準。線性評價應有5個不同濃度，可選擇低值和高值標本各一個，低值標本為1號，高值標本為5號，二者3：1混勻為2號，等份混勻為3號，1：3混勻為4號，2-4號標本的濃度按下式計算：

標本濃度 = (C1V1 + C5V5)/(V1 + V5)C = 濃度，V = 體積。

(四)干擾試驗

1.目的要求 判斷評價方法給出的結果是否受非分析物影響及影響程度。①干擾是指在測定某分析物的濃度或活性時，受另一非分析物影響而導致測定結果增高(正干擾)或降低(負干擾)。②干擾物質可分為內源性(標本中存在的)和外源性(外界污染的)兩類。③干擾的機理，可有物理作用、化學作用以及非特異反應等。④干擾可能是造成誤差的一個重要原因，如果干擾物是恒定的將引起恒定誤差，如干擾物隨病理生理因素影響，將引起隨機誤差。

2.試驗前準備 ①應做的主要干擾物為病人標本中常常出現的黃疸，脂血和溶血;某些藥物如維生素C等;實驗常用的抗凝劑，防腐劑和穩定劑。②質量保證，不存在系統誤差;批內精密度在可接受范圍內;應不存在前后結果的交叉污染;實驗過程有質控監督。

3.干擾試驗方法

(1)"配對差異"試驗:即將不同濃度的干擾物加入到實驗標本中，然后分別測定加與不加干擾物的標本，比較二者有無偏差，并了解干擾物濃度與偏差程度的關系。

(2) 用病人標本作偏差分析: ① 本分析用來證實某類病人標本中是否存在未知的干擾物;進一步肯定加入干擾物實驗的結論。② 選擇2組病人標本，一組含疑似干擾物為測定組，另一組不含疑似干擾物作為對照組，兩組的分析物濃度范圍應大致相同，每組標本需20~40個。③ 兩組樣品分別用試驗方法和比較方法(參考方法)雙份測定，并在2小時內完成。④ 分別比較每組樣品，兩種方法間的差異，如測定組有差異，對照組無差異說明存在干擾，如兩組均無顯著差異說明不存在干擾。

4.試驗步驟 ①實驗材料應選擇混合血清1份，分成2份，1 份加入干擾物，含量為臨床標本中可能出現的最高含量，另一份不加，按比例混合成5個不同干擾物濃度。(見線性評價)②每份標本重復測定n次。
 

(五)統計分析及評價

1.精密度統計評價

(1) 離群點的檢查 如每次雙份測定的差值超過初步精密度測定時±標準差的5.5倍(是99.99%的上限值)，這時數據為"離群點"，應棄去或重做。

(2) 統計分析 見計算公式。例如日平均均值=0.949 , S日間(B) = 0.033.

CV日間 = B/日平均均值×100% = 3.48%

S批間(A)= n = 測定天數

CV批間 = A/日平均均值×100% = 2.46%

S批內(A)=

CV批內 = S批內/日平均均值×100% = 2.23%

S總 =

CV總 = S總/日平均均值×100% = 4.19%

2.準確度統計評價

(1) 方法內雙份測定的離群點檢查 計算每一標本的DX和DY以及DX′和DY′。如分別超過DX和DY以及DX′和DY′值的4倍為離群點，應剔除，如出現一個以上離群點，應查找原因，必要時重做。

(2) 試驗方法(Y)與比較方法(X)相關性 如 r≥0.975或r2≥0.95說明二法的相關良好。

3.線性評價方法

(1) 測定結果 5個不同濃度的標本，隨機排列，每個標本測定4次，因此標本應有足夠的量，并且分析要求在當天完成。

(2) 離群點檢查 將每個標本(X1到X5)4次測定的結果排列在Y1-Y4，如數據超過界限值P0.05 = 0.765和P0.01 = 0.889為離群點。

(3) 線性評價統計 采用回歸分析。

(4) 稀釋變異試驗 界限值P0.05 = 0.6841; P0.01 = 0.7814;如

(5) 線性失擬檢查 界限值F0.05 = 3.29; F0.01 = 5.42;如< F0.05說明線性良好。

4.干擾實驗統計評價

計算分析干擾 各組均值 - 未加干擾物相應組的均值 = 干擾值。對照這一濃度±1.96 s，可得出某濃度內有無干擾。

如Bias<允許誤差(EA)的臨界值(EA為可允許誤差的95%限度)，表明由于干擾物引起的偏差對臨床診斷和治療不產生不良的影響，是可以被接受的。

三 方法學性能分析

方法學性能標準也稱分析目標，由允許分析誤差和醫學決定水平這兩項內容決定。① 允許分析誤差 用EA表示，它被規定為95%樣品的允許誤差限度;② 醫學決定水平 用XC表示，是臨床判斷結果具有意義的被分析物濃度。制定的性能標準，既應反映臨床應用與解釋結果的要求，稱為醫學效用限度，又應基本符合實驗室所能達到的技能狀態。

候選方法可否被接受，最后根據評價方案中的誤差結果進行歸納，作出判斷。任何一項指標大于可允許誤差，該方法都不能接受。如果候選方法被得出可接受性的結論，那么接著就要進行評價后實驗，包括參考值的制定，制定的參考值及其范圍應符合以前公認的調查報告;質控觀察，應符合室內質控的要求;臨床病例的觀察等。最后進入方法應用階段。